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题目：Genome organization and chromatin analysis identify transcriptional downregulation of insulin-like growth factor signaling as a hallmark of aging in developing B cells

通过基因组组织和染色质结构分析确定了胰岛素样生长因子信号的转录下调是B细胞开始衰老的标志

期刊：Genome Biology

影响因子：13.214

主要技术：Short RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、Hi-C、PCHi-C

研究背景

衰老的特征是适应性免疫系统功能的丧失，但其根本原因却鲜为人知。为了评估年龄对B细胞发育的影响，作者对组蛋白修饰和染色体构象相关的基因表达和染色质特征进行了分析，使用的实验材料来自不同年龄阶段的小鼠的pro-B和pre-B细胞。

研究内容及结果

1. 在衰老过程中，平均pro-B和 pre-B细胞数量分析

使用多参数流式细胞分析小鼠骨髓B细胞，发现老年小鼠的pre-B细胞发生实质性的变化(图1)，老年的(三个月)与年轻的老鼠(约19 - 22日)相比，pro-B细胞大约减少了两个(图1 c)、pre-B细胞却有着近两倍数量的减少(图1 d)，该结果与先前的报道一致。与此相反的是，发现在老年小鼠骨髓中会重新循环成熟的B细胞（图1e），不能排除被分类的衰老pro-B细胞群体中存在少量成熟B细胞污染。可能是由于成熟B细胞再循环数量增加，以及在衰老的骨髓中，B细胞前体(IgM-)和成熟细胞(IgM+)分离不那么明显。

图1 衰老小鼠B细胞前体基因表达变化

2. pro-B和pre-B 细胞中的基因表达分析

对核糖体RNA (rRNA)耗尽的总RNA转录组分析发现，衰老pro-B细胞中有82个显著上调和54个下调基因，衰老pre-B细胞中有23个上调和33个下调基因（图2 a , b）。pro-B细胞和pre-B细胞之间的年龄特异性表达变化是相关的，即使只有一种细胞类型也能达到显著性（图2 c）。在pro-B和pre-B细胞阶段的老化过程中，一些基因被降低了，这些基因编码胰岛素样生长因子（IGF）信号传导途径的组成部分，如IRS1和IGF1r。IRS1是通路的一个关键组成部分，被发现其是衰老pre-B细胞信使RNA (mRNA)水平上最显著的下调基因。因此，作者研究了IRS1蛋白水平，发现在pro-B细胞和pre-B细胞的老化过程中，蛋白含量都有所下降，这表明IRS1介导的特定年龄mRNA变化会降低蛋白质水平（图2d）。对于衰老前B细胞中下调的基因，在32个启动子中，有19个启动子的活性启动子或活性调控区域状态被降低。与大多数上调基因的观察结果相似，这些变化大多是细微的，与这些基因表达中相对较小的折叠变化相一致(图2b)。

图2 基因表达在pro-B和pre-B 细胞随着年龄的老化而改变

3. 初期的pro-B 和pre-B细胞的RNA和microrna表达分析

总RNA水平既反映了转录速率，也反映了RNA稳定性等下游过程。为了更直接地探讨衰老对基因转录的影响，作者从年轻和衰老的pro-B细胞中分离出核RNA，以丰富新生转录本，并以内含子转录的整体变化作为新生转录的一种具体衡量指标。同时，在总RNA中检测到17%(175个中有30个)的DEGs在核RNA测序(RNA-seq)分析中也是DEGs，并且整体的折叠变化是相关的，从而可以认为更多的基因存在与年龄相关的显著性差异转录（图3a）。值得注意的是，一些年龄下调基因，如Plxdc2、Igf1、Igf2bp3和Igf1r，以及上调的基因，如Adam19和Tmem163，都与IGF信号或2型糖尿病有关。更广泛地说，DEGs的KEGG 通路分析突出了几个与营养信号相关的代谢通路。

通过核RNA-seq分析显示Nespas是衰老pro-B细胞中最显著的下调基因之一（图3a）。Nespas是非编码转录本，参与调控印迹，是miRNAs miR-296和miR-298的非编码前体RNA。为了探索B细胞前体中miRNA表达与衰老的关系，作者进行了小RNA-seq，在pro-B细胞和pre-B细胞中鉴定出34个有差异显著的mirna（图3b、c）。其中20.6%在pro-B细胞和pre-B细胞中均表现出表达差异。该分析证实了miR-296和miR-298的显著下调，与新生RNA-seq检测到的Nespas水平变化一致。作者还观察到7个Let-7家族基因和miR-223在pro-B和pre-B细胞衰老时上调(图3b, c)。不同表达的microrna在衰老过程中被分离成簇，表达变化相似，并且其中一些表达在pro-B细胞和pre-B细胞之间也有调节作用(图3c)。

Let-7 mirna由12个具有相同序列的成员组成，分别从基因组位点Let-7a1、Let-7a2、Let-7b、Let -7c、Let -7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f1、Let-7f2、Let-7g、Let-7i和miR-98进行表达。Let-7b和7 c在年老的pre-B细胞显著上调microrna，作者检查了核RNA-seq数据，年老的pro-B细胞非编码RNA 在15号染色体上显著增加。因此推测，这个转录组可能是这些microrna的RNA前体。

图3 初期的pro-B和pre-B细胞的RNA和microrna表达随着年龄的老化而改变

4. 染色质可及性和pre-B细胞中的H3K27me3与年龄相关的变化分析

在老年pre-B细胞中，发现10个可及性明显较低的区域和4个可及性较高的区域(图4a)。可及性低的两个区域与Irs1启动子区域重叠，另一个区域与Irs1转录终止位点接近(

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